การพัฒนาวิธีการแยกบริสุทธิ์สายเปปไทด์ที่ถูกเชื่อมต่อกันเพื่อศึกษาโครงสร้างสามมิติและการปฏิสัมพันธ์กันของโปรตีน

               ในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตทุกชนิดมีโปรตีนเป็นส่วนประกอบสำคัญ ในระดับเซลล์โปรตีนมีหน้าที่ต่างๆ อาทิ เช่น การขนส่งสาร การสื่อสาร การป้องกัน การทำงานที่แตกต่างกันนั้นขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายประการ ได้แก่ รูปร่างสามมิติ การดัดแปลงของโปรตีนหลังการสังเคราะห์ รวมถึงการปฏิสัมพันธ์กันเพื่อการทำงานอย่างจำเพาะ ข้อมูลและความรู้เกี่ยวกับปัจจัยดังกล่าวนี้จึงเป็นส่วนสำคัญในการเข้าใจการทำงานของเซลล์สิ่งมีชีวิต

                การใช้สารเคมีจำเพาะเพื่อเชื่อมโปรตีนที่ปฏิสัมพันธ์กันนั้นได้มีการใช้กันอย่างแพร่หลาย ซึ่งเทคนิคนี้สามารถให้ข้อมูลในเชิงระยะห่างระหว่างกรดอะมิโนที่ถูกเชื่อมต่อกัน เนื่องจากกรดอะมิโนเหล่านี้ไม่สามารถอยู่ห่างกันเกินกว่าขนาดของสารเคมีที่ใช้เชื่อมต่อได้ ข้อมูลด้านระยะห่างนี้สามารถใช้เพื่อประเมินโครงสร้างสามมิติของโปรตีนและโปรตีนที่ปฏิสัมพันธ์กันได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสามารถช่วยให้ข้อมูลที่เป็นประโยชน์แก่โครงสร้างสามมิติที่ยังไม่สมบูรณ์ซึ่งอาจสร้างโดยเทคนิคอื่นๆ เช่น  X-ray scattering หรือ Cryo electron microscopy

                ในการวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติและการปฏิสัมพันธ์กันของโปรตีนนั้น โปรตีนจะถูกเชื่อมกันด้วยสารเคมีจำเพาะ หลังจากนั้นโปรตีนที่ถูกเชื่อมต่อจะถูกย่อยเป็นเปปไทด์สายสั้นๆด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ เนื่องจากปริมาณของสายเปปไทด์ที่ถูกเชื่อมด้วยสารเคมีจำเพาะนั้นมีปริมาณที่น้อยมากเมื่อเปรียบเทียบกับสายเปปไทด์ปกติ ส่งผลให้การวิเคราะห์หาตำแหน่งของกรดอะมิโนที่ถูกเชื่อมในสายเปปไทด์ด้วยเทคนิคแมสสเปกโตรมีทรีมักล้มเหลวหรือเป็นไปอย่างไม่มีประสิทธิภาพ ยิ่งไปกว่านั้นข้อมูลที่ได้จากการวิเคราะห์เป็นข้อมูลที่ซับซ้อนจำเป็นต้องมีโปรแกรมคอมพิวเตอร์ที่จำเพาะในการวิเคราะห์

                ในปัจจุบันมีหลายกลุ่มวิจัยทั่วโลกได้พัฒนาและปรับปรุงทั้งในด้านสารเคมีจำเพาะที่ใช้เชื่อมต่อโปรตีน วิธีการแยกบริสุทธิ์ของสายเปปไทด์ที่ถูกเชื่อม และโปรแกรมวิเคราะห์ ในส่วนของผู้วิจัยได้มีส่วนร่วมและประสบความสำเร็จในการพัฒนาวิธีแยกบริสุทธิ์สายเปปไทด์ที่ถูกเชื่อมโดยใช้ปฏิกริยา [3+2] cycloaddition reaction ซึ่งการทดลองนี้สามารถให้ข้อมูลการปฏิสัมพันธ์กันในระดับกรดอะมิโนของเอนไซม์ B.subtilis RNA polymerase นอกจากนี้ ทางกลุ่มผู้วิจัยยังได้พัฒนาวิธีแยกบริสุทธิ์สายเปปไทด์ที่ถูกเชื่อมโดยใช้ปฏิกริยา Reduction ของหมู่ Azido group ที่อยู่บนสารเคมีจำเพาะ และเทคนิค Diagonal SCX chromatography รวมถึงการพัฒนาโปรแกรมคอมพิวเตอร์เพื่อการวิเคราะห์ จากการทดลองนี้กลุ่มผู้วิจัยประสบความสำเร็จในการศึกษาโครงสร้างสามมิตและการปฏิสัมพันธ์กลุ่มกันของโปรตีนต่างๆใน HeLa nuclear extract สำหรับผู้ที่สนใจสามารถหาข้อมูลเพิ่มเติมได้ตามบทความต่อไปนี้ครับ

1)            A gas phase cleavage reaction of cross-linked peptides for protein complex topology studies by peptide fragment fingerprinting from large sequence database. Buncherd H, Roseboom W, de Koning LJ, de Koster CG, de Jong L. J Proteomics. 2014 May 17;108C:65-77. doi: 10.1016/j.jprot.2014.05.003

2)            Isolation of cross-linked peptides by diagonal strong cation exchange chromatography for protein complex topology studies by peptide fragment fingerprinting from large sequence databases. Buncherd H, Roseboom W, Ghavim B, Du W, de Koning LJ, de Koster CG, de Jong L. J Chromatogr A. 2014 Jun 27;1348:34-46. doi: 10.1016/j.chroma.2014.04.083. Epub 2014 May 2.

3)            Selective enrichment and identification of cross-linked peptides to study 3-D structures of protein complexes by mass spectrometry. Buncherd H, Nessen MA, Nouse N, Stelder SK, Roseboom W, Dekker HL, Arents JC, Smeenk LE, Wanner MJ, van Maarseveen JH, Yang X, Lewis PJ, de Koning LJ, de Koster CG, de Jong L. J Proteomics. 2012 Apr 3;75(7):2205-15. doi: 10.1016/j.jprot.2012.01.025. Epub 2012 Feb